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滤光片在流式细胞仪中的应用
  • 发布日期:2018-12-22      浏览次数:234
    •   流式细胞仪(flow cytometry,FCM)是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。
       
        工作原理简介:采用激光作为激发光源,保证其具有更好的单色性与激发效率;利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术,保证检测的灵敏度和特异性;用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析,保证了检测速度与统计分析性。
       
        流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统;②激光光源及光束形成系统;③光学系统;④信号检测与存储、显示、分析系统;⑤细胞分选系统。
       
        其中激光光源及光束形成系统:流式细胞仪可配备一根或多根激光管,常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488nm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633nm)和/或紫外激光管。
       
        流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源。
       
        在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致。
       
        光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组。
       
        流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔(一般为2片透镜、1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。
       
        滤光片主要有三类:长波通滤光片(LPF)--只允许特定波长以上的光线通过,短波通滤光片(SPF)--只允许特定波长以下的光线通过,带通滤光片(BPF)--只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LPF550和BPF525,接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LPF600和BPF575,接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LPF650和BPF675。
       
        流式细胞仪发明的初期,主要应用在对细胞的分选上,随着计算机技术,免疫学的发展以及单克隆抗体技术的发明,随后才在生物学和医学、药学等领域的应用越来越广泛,如细胞动力学分析、细胞调亡、细胞分型、肿瘤的诊断、药物疗效分析等许多领域。近年来,新型多功能流式细胞仪的开发,多参数分析技术的建立,以及各种功能强大的分析软件的开发等,为流式细胞仪检测结果准确性的提高和分析能力的扩展提供了保障,可以相信,在未来生物学和医学领域,流式细胞仪的应用范围会进一步扩大,应用深度会进一步加强。
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